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  •   天欣泰对大鼠实验性脑缺血的保护作用    3星级
    天欣泰对大鼠实验性脑缺血的保护作用
      吉林华康药业天欣泰血栓心脉宁片       更新时间:2012-10-19
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     天欣泰血栓心脉宁片对大鼠实验性脑缺血的保护作用
    刘建伟,曲绍春,于晓风,徐华丽,睢大筼
     
    要:目的  观察天欣泰血栓心脉宁片对大鼠实验性脑缺血的保护作用。方法 结扎双侧颈总动脉伴低血压复制大鼠不完全性脑缺血模型,将动物随机分为假手术组、模型组、天欣泰血栓心脉宁片低剂量组、中剂量组及高剂量组。测定脑含水量、脑指数、血小板粘附及聚集功能,全血粘度及血浆粘度,脑组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、钙离子(Ca2+)及乳酸(LA)等指标。结果 与模型组比较,天欣泰血栓心脉宁片给大鼠连续灌胃7天,中、高剂量组可明显降低实验性脑缺血大鼠的脑含水量及脑指数(P<0.05或P<0.01),能明显抑制血小板粘附及聚集功能(P<0.05或P<0.01),提高脑组织SOD活性,降低MDA、Ca2+及LA含量(P<0.05或P<0.01)。 结论  天欣泰血栓心脉宁片对大鼠实验性脑缺血具有明显保护作用,可能通过抑制脑缺血时自由基的氧化损伤,改善血小板粘附及聚集功能,防止乳酸酸中毒和细胞内钙超载等机制实现的。
     
    关键词:天欣泰血栓心脉宁片;脑缺血;血小板功能;自由基;钙离子;乳酸
    中图分类号: R-322 ;Q548   文献标识码:
     
    The Protective Effects of XXNT on experimental cerebral ischemia in rats
    Liu Jianwei, Qu Shaochun, Yu Xiaofeng, Xu Huali, Sui Dayuan
    (Department of Pharmacology, School of Pharmacy, Jilin University, Changchun Jilin 130021)
        
    Abstract:  Objective To observe the protective effect of Xueshuanxinmaining Tablet (XXNT) on experimental cerebral ischemia in rats.  Methods In cerebral ischemia model induced by bilateral common carotid artery clamping and controlled hemorrhage to a mean arterial pressure of 50 mmHg, cerebral water content and index, platelet adhesion and aggregation functions, the blood viscosity and plasma viscosity, malonydialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD) activity, Ca2+ and lactic acid (LA) contents were measured.  Results The cerebral water content and index were decreased, the platelet adhesion and aggregation functions were inhibited, the activity of SOD increased and the contents of MDA,Ca2+  and LA decreased in brain tissue(P<0.05 or P<0.01).  Conclusion XXNT can protect the cerebral tissue from ischemia injury by suppressing oxidative damage of free radical during cerebral ischemia, improving platelet adhesion and aggregation functions, preventing acidosis of lactic acid and overload of calcium in cell etc.
    Key words: XXNT;Cerebral ischemia; Platelet function;Free radical; Ca2+;LA
     
     
     
    天欣泰血栓心脉宁片(XXNT)是以祖国传统中医药理论为基础,以道地名贵中药材为原料,采用现代先进工艺精制加工而成的纯中药制剂,主要由川芎、丹参、水蛭、麝香、牛黄、毛冬青、槐花、人参茎叶皂苷、冰片、蟾蜍等十种中药材组成。具有芳香开窍、活血散瘀功能,主治脑血栓、冠心病、心绞痛属于血瘀证者。我们前期研究表明,天欣泰血栓心脉宁片对大鼠急性心肌梗死具有明显保护作用,可能与其增强抗氧化酶活性,减少自由基对心肌的氧化损伤,纠正心肌缺血时PGI2/TXA2失衡以及抑制血小板聚集活性等机制有关[1]。本文进一步采用大鼠结扎双侧颈总动脉伴低血压模型,探讨天欣泰血栓心脉宁片对实验性脑缺血的影响,为其临床应用提供科学依据。
     
    材料和方法
    1.1  实验动物: Wistar大鼠,雌雄各半,体重260~300g,合格证号:医动字第10-5112,由吉林大学实验动物部提供。
    1.2  药品和试剂:XXNT(0.4g/片,用法用量:口服,一次2片,一日3次)由吉林华康药业股份有限公司供给,批号:20070108,实验时以0.5%羧甲基纤维素钠配制成所需浓度使用;SOD、MDA 及Ca2+试剂盒,均购于南京建成生物技术研究所。
    1.3  动物分组与给药:取 100只Wistar大鼠,雌雄各半,按体重随机分成5组,即:假手术组、模型组、XXNT小、中、大剂量组,每组20只。药物组大鼠灌胃XXNT  200、400、800mg/kg,假手术组及模型组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠,灌胃体积均为0.2ml/100g体重,每日1次,连续7日。
    1.4  脑缺血模型建立[3]:动物于末次给药后1小时用氯醛糖0.3g/kg 腹腔注射麻醉,灯照保温,是肛温维持37~37.5℃,股动脉插管监测血压,股静脉插管用于再灌。塑料管从外颈静脉插入右心房供放血用。连续记录脑电图(EEG),用抽血的方法放血,失血达到10.7kPa(80mmHg)时分离双侧颈总动脉并结扎,再继续抽血,当血压下降到6.7kPa(50mmHg)时,EEG呈一直线,此时即造成不完全性脑缺血模型,维持15min。假手术组只插管,不放血及结扎。抽出的血放入肝素化试管中37℃水浴保存,以备血压过低时回输。180 min后,每组动物均以戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,用LBY-F5血小板粘附仪(北京普利生集团生产)测定血小板粘附功能[2],根据公式{ ( 粘附前血小板数-粘附后血小板数 ) / 粘附前血小板数×100% }计算血小板粘附率;采用LBY-NJ2血小板聚集仪(北京普利生集团生产)测定血小板聚集功能 [2] ,求出1、3和5 min的血小板聚集率(PAG)及最大血小板聚集率(MPAG)。然后断头处死,开颅取脑,去除嗅脑、小脑、脑干后称重,计算脑指数[脑指数=(脑重×100)/体重]。取大脑左侧半球称湿重,然后放入110℃烤箱中烤至恒重,称其干重,计算脑含水量[脑含水量 =(脑湿重-脑干重)/脑湿重×100%];右侧半球放置冰盆上,用冰生理盐水冲去残血,按质量:体积比为1:9的比例在冰浴下以冰生理盐水为匀浆介质制备10%脑组织匀浆,分装4个1.5ml Eppendorf管中。于4℃以3500转/分离心10分钟,取上清采用721紫外分光光度计分别测定脑组织SOD、MDA及Ca2+,以对羟基联苯法测定脑组织LA含量。
    1.5 统计学方法:实验数据用SPSS 10.0 统计软件处理,以均数±标准差( ±s)表示,组间比较采用方差分析。
     
    2
    2.1  XXNT对实验性脑缺血大鼠脑含水量及脑指数的影响  与假手术组比较,模型组大鼠脑含水量及脑指数明显增加(p<0.01)。与模型组比较,XXNT 400、800mg/kg组均能明显减少实验性脑缺血大鼠脑含水量及脑指数(p<0.05或p<0.01),200mg/kg对脑含水量及脑指数无明显影响(p>0.05),见表1。
     
    表1  对实验性脑缺血大鼠脑组织含水量及脑指数的影响(n=10, ±s)
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
       组  别       剂量(mg/kg)        脑含水量(%)            脑指数
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    假手术组           —           70.33±4.76         0.513±0.085 
    模型组             —           80.18±5.03##       0.698±0.135##
      XXNT             200            78.15±7.25         0.685±0.161
                        400           74.68±5.37*        0.573±0.102*
                        800           71.76±7.12**       0.528±0.118**
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    与假手术组比较,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
     
    2.2          XXNT对实验性脑缺血大鼠脑组织SOD活性及MDA、LA和Ca2+含量的影响 与
    假手术组比较,模型组脑组织SOD活性明显降低,MDA、LA和Ca2+含量明显增高(P<0.05或p<0.01)。与模型组比较,XXNT 400、800mg/kg组均能明显升高脑组织中SOD活性,降低MDA、LA和Ca2+含量(P<0.05或p<0.01),XXNT 200mg/kg对SOD活性及MDA、LA和Ca2+含量均无明显影响(p>0.05),见表2。
     
    表2  对实验性脑缺血大鼠脑组织SOD活性及MDA、LA和Ca2+含量的影响(n=10, ±s)
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    组  别         剂 量       SOD            MDA              LA              Ca2+
    (mg/kg)    (nu/mgprot)       (nmol/ml)          (μmol/g)      (mmol/gprot)
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    假手术组        —     13.44±3.27      5.20±1.44      14.63±3.22     0.015±0.011
    模型组          —       8.75±2.76##      7.75±2.82##     23.03±6.17##     0.034±0.017#
    XXNT              200      9.01±3.73      6.82±2.38       21.46±5.87     0.028±0.019
                    400     12.18±3.17*        5.91±1.36*      16.41±4.93*    0.017±0.012*
                   800     13.20±3.26**    5.38±1.25**     15.12±4.25**   0.016±0.016*
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    与假手术组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
     
    2.3          XXNT对实验性脑缺血大鼠血小板粘附性的影响  假手术组的血小板粘附率(%,x±sn=10)为0.064±0.018,而模型组的血小板粘附率为0.142±0.043,明显高于假手术组(P<0.01)。XXNT 200、400、800mg/kg组的血小板粘附率分别为0.135±0.051、0.094±0.036、0.078±0.027。与模型组比较,XXNT 400、800mg/kg组均能明显降低血小板粘附率(P <0.05或 P <0.01),XXNT 200mg/kg组对血小板粘附率无明显影响(P>0.05),见图1。
     
    与假手术组比较,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
    图1  XXNT对实验性脑缺血大鼠血小板粘附性的影响
    2.4  XXNT对实验性脑缺血大鼠血小板聚集功能的影响  与假手术组比较,模型组1、3、5 min及最大血小板聚集率均明显增高(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,XXNT 400、800mg/kg组均能明显地降低ADP诱导的1、3、5 min及最大血小板聚集率 (P<0.05或P<0.01),XXNT 200mg/kg组对血小板聚集率无明显影响(P>0.05),见表3。
     
    表3  对实验性脑缺血大鼠血小板聚集功能的影响(n=10, ±s)
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    组别         剂 量                   PAG(%)                          MPAG                      
             ───────────────────
    (mg/kg)     1min          3min           5min           (%)                               
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    假手术组      —   25.87±7.34     30.66±7.52    16.49±4.08     37.14±6.13
    模型组        —     40.12±13.5#   48.42±10.2##  29.42±10.8##  52.87±15.0##
    天欣泰血栓心脉宁片  200   38.10±10.2     45.65±13.8     30.01±15.2     50.85±14.7
    400    28.48±9.08*    35.82±12.7*   21.84±8.53*   40.73±10.6*
    800     26.51±10.1*   31.26±9.48**   19.21±9.05*    37.27±9.01**
    ━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━
    与假手术组比较,#p<0.05,##p<0.01;与模型组比较,*p<0.05,**p<0.01
     
       
    脑缺血时由于毛细血管通透性增加,大量血浆成份外渗,尤其水份及小分子物质,引起脑组织明显水肿。脑水肿可使颅压升高,严重时导致脑疝而危及生命。近年研究发现[3],在某种程度上不完全性脑缺血引起的脑损伤比完全性脑缺血更为严重。现已知,脑缺血后的损伤与多种因素有关,主要包括兴奋性氨基酸增多、细胞内钙超负荷、氧自由基的损伤、乳酸酸中毒及花生四烯酸代谢活性升高等。这些因素彼此交叉,共同构成脑缺血后的脑实质损伤[4]
    脑缺血期间,葡萄糖有氧氧化受阻转变为无氧酵解,导致细胞内乳酸堆积,pH下降。若乳酸升高超过25pmol/g时,就会产生不可逆的神经元损伤。离体实验证明,当pH从7.0降低到6.0时,脑脂质过氧化速率增加10倍。因此,乳酸堆积对脑组织极为不利[5]天欣泰血栓心脉宁片能明显降低脑组织含水量及乳酸堆积,并减少脑组织病理改变,提示其可能通过抑制无氧酵解及降低脑水肿产生保护脑缺血作用。
    脑缺血时由于兴奋性氨基酸释放增加,作于其受体,引起受体门控型Ca2+离子通道开放,使Ca2+大量内流。此外,线粒体及内质网膜Ca2+-ATP酶由于能量代谢障碍而不能摄取细胞内过量的Ca2+而进一步加重Ca2+超载。细胞内超载Ca2+可激活磷脂酶C,后者使磷脂酰胆碱转变为三磷酸肌醇和二酯酰甘油,三磷酸肌醇作用于其受体,导致细胞内Ca2+库释放Ca2+,各种因素互相交叉促使细胞内Ca2+超载。这是最终引起神经元不可逆性坏死的主要原因。因而有效的降低脑组织中Ca2+含量,可减轻脑细胞的不可逆性坏死[6]天欣泰血栓心脉宁片对实验性脑缺血大鼠能明显降低脑组织Ca2+含量,表明其对脑组织的保护作用可能与降低脑组织中Ca2+含量有关。
       脑缺血时细胞内Ca2+超载可激活依赖Ca2+蛋白水解酶,使黄嘌呤脱氢酶变成黄嘌呤氧化酶。次黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶作用下生成黄嘌呤,进而生成尿酸,这两个过程均产生大量氧自由基,可攻击生物膜中多聚不饱和脂肪酸引起脂质过氧化作用,形成脂质过氧化物,降低膜的流动性,使膜的通透性增加,大量水分离子内流,导致线粒体及细胞肿胀,抑制电子传递和氧化磷酸化,进一步加重能量代谢障碍,溶酶体酶释放引起细胞自身消化,最终导致细胞死亡[78]天欣泰血栓心脉宁片能明显降低实验性脑缺血大鼠脑组织MDA含量,并提高SOD活性,提示其可能通过清除氧自由基及提高抗氧化酶活性对脑组织产生保护作用。
    脑缺血时脑组织能量代谢障碍,使无氧糖酵解增加,从而导致酸中毒,再加上自由基的大量生成均可使血管内皮细胞受损,激活血小板,引起其粘附、聚集和释放反应。同时细胞内Ca2+超载,可激活血小板膜上磷脂酶C和磷脂酶A2,使得膜磷脂降解释放花生四烯酸,在环加氧酶作用下最终生成血栓烷A2,具有强烈收缩血管,促进血小板聚集作用[9]天欣泰血栓心脉宁片能显著降低血小板粘附率,1、3和5 min的血小板聚集率及最大血小板聚集率,说明其能抑制血小板粘附和聚集功能,有利于防治血栓的形成。
     
    参考文献
    [1] 赵星宇,睢大员,于晓风,等.  天欣泰血栓心脉宁片对大鼠急性心肌梗死的保护作用及其机制[J]. 中西医结合心脑血管病杂志, 2008,6(2):177
    [2] 吴勇杰,周尔风. 甲基黄酮醇对兔血小板聚集的影响[J]. 中国药理学报,1988,9(1):79-83.
    [3] Smith  ML, Bendek G .  Models for studying long-term recovery following forebrain ischemia in the rat[J].  Acta Neurol Sc, 1984,69:385-401.
    [4] 唐康,张均田. 脑缺血损伤机制和治疗策略研究进展[J]. 中国新药杂志,2000,9(12):809-812.
    [5] 赵玉武,丁素菊,郑惠民. 硫酸镁对大鼠脑缺血及再灌注时细胞外液谷氨酸、葡萄糖和乳酸的影响[J]. 第二军医大学学报, 2004,25(10):1108-1110.
    [6] 赵红梅,于晓风,曲绍春,等. 麝香抗栓丸对大鼠实验性脑缺血的保护作用[J]. 中草药, 2004,35(7):784-787.
    [7]  Slater TF.  Free-radical mechanism in tissue injury[J].  Biochem J,1984,222:1-3.
    [8] 王天,徐华丽,曲绍春,等. 碟脉灵注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用[J]. 吉林大学学报(医学版), 2006,32(1):78-81.
    [9] 赵红梅,于晓风,曲绍春,等. 麝香抗栓丸对实验性脑缺血大鼠血小板功能及血液黏度的影响[J].   吉林大学学报(医学版),2004,30(3):393-394,426.       
     
    作者简介刘建伟(1970-),男,毕业于吉林大学药学院,现工作于吉林华康药业股份有限公司(邮
    编:130021);曲绍春、于晓风、徐华丽、睢大筼(通讯作者  Tel:0431-85619705  E-mail:
    suidy@jlu.edu.cn),工作于吉林大学药学院药理教研室(邮编:130021)。
     
     
     
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