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    天欣泰对大鼠脑缺血再灌注肿瘤坏死因子的影响
      吉林华康药业天欣泰血栓心脉宁片       更新时间:2012-10-19
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    天欣泰血栓心脉宁对大鼠脑缺血再灌注肿瘤坏死因子的影响
    李国前,杨小霞,王杰华,洪诸权
    (福建医科大学附属泉州第一医院神经内科,泉州 36200)
    摘要:目的 探讨天欣泰血栓心脉宁对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的影响。方法 36只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组,再灌注术后24h断头取脑,免疫组织化学和RT-PCR法观察脑组织TNF-α表达水平的变化。结果 大鼠脑缺血再灌注损伤后,TNF-α表达升高;与模型组相比,治疗组TNF-α表达显著下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论 天欣泰血栓心脉宁的脑保护作用可能与抑制TNF-α的表达有关。
    关键词天欣泰血栓心脉宁;缺血再灌注损伤;TNF-α
    The Effects of Xueshuanxinmaining Tablet on the Expression of TNF-α in Rats with Focal Cerebral Ischemia-Reperfusion
    Li Guo-qianWang Jie-huaYang Xiao-xiaHong Zhu-quan
    (Department of NeurologyQuanzhou first Affiliated Hospital of Fujian Medical CollegeQuanzhou 362000Fujian ProvinceChina)
    AbstractObjective  To investigate the effect of Xueshuanxinmaining Tablet on the expression of TNF-αon cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Method  Male adult Sprague-Dawley rats were randomly assigned into three groups : sham operation group, model group, and Xueshuanxinmaining Tablet group. The middle cerebral artery occlusion reperfusion model was made by the suture method. The level of TNF-αexpression were measured by immunohistochemical and RT-PCR. Results  Compared with the sham operation group, the expressions of TNF-α were increased significantly in model group(P< 0.05).Compared with the model group, the TNF-αexpression was downregulated in rats of Xueshuanxinmaining Tablet group(P< 0.05). Conclusion  Xueshuanxinmaining Tablet has significant protection on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats, which may be related to the inhibition of TNF-αsecretion and expression in brain tissue.
    Key wordsXueshuanxinmaining Tablet;Cerebral Ischemia-Reperfusion;TNF-α
       脑缺血再灌注后的病理生理过程中有许多炎性因子的参与[1]。肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-ɑ,TNF-α)在缺血损伤后引起的白细胞浸润和组织损伤中起重要作用,可诱导炎性细胞因子和细胞粘附因子等表达,参与脑梗死发生发展过程[2]。本研究采用天欣泰血栓心脉宁对脑缺血再灌注损伤大鼠进行治疗干预,观察大鼠脑组织TNF-α的表达,探讨天欣泰血栓心脉宁的脑保护作用机制。
    1 材料和方法
     实验试剂 Sprague-Dawley雄性大鼠36只,体重250~300g,福建医科大学动物实验中心提供。天欣泰血栓心脉宁,吉林华康药业股份有限公司提供,实验时以0.5%羧甲基纤维素钠配制成所需浓度。TNF-α兔抗鼠多克隆抗体,Santa Cruz公司;即用型免疫组化试剂盒、AEC试剂盒,福州迈新公司;Trizol试剂,Invitrogen公司;PCR试剂盒及逆转录试剂盒,MBI Fermentas公司。
    1.2 实验方法 大鼠随机分为假手术组、模型组、治疗组,每组12只。造模前药物组每日灌胃给药1次(800mg/kg),连续6d,假手术组及模型组给予等体积0.5%羧甲基纤维素钠。参考改良Zea-Longa线栓法[3]制备大鼠大脑中动脉栓塞模型。血流阻断1h后拔出线栓,形成再灌注。假手术组大鼠接受相似手术处理,但是不插入线栓。
    1.3 免疫组织化学法检测TNF-α蛋白的表达  大鼠于再灌注后24小时断头取脑切片。切片经脱腊至水,3%H2O2 室温孵育10min,微波抗原修复10min。滴加10%正常山羊血清,室温封闭20min。甩去多余液体,加入兔抗大鼠TNF-α一抗,4℃过夜。次日滴加聚合物增强剂,室温下孵育20min。滴加酶标山羊抗鼠/兔IgG聚合物,室温下孵育30min。AEC显色,镜下控制。自来水冲洗,苏木素复染,水性封片剂封片。各步骤间用0.01mol/L PBS冲洗3遍。在400倍光学显微镜下观察胞浆呈红色染色的阳性细胞,分别随机选取5个视野,计数免疫反应阳性细胞数。
    1.4 RT-PCR法检测TNF-α mRNA的表达 取大鼠脑组织用Trizol试剂严格按照说明书进行总RNA提取。逆转录反应条件为:70℃ 5min,42℃ 60min,70℃10min,终止反应,-20℃保存备测。TNF-α上游引物:5’- ccagaccctcacactcagatca -3’,下游引物:5’- ggaggctgactttctcctggta -3’(扩增产物290bp),β-actin上游引物:5'- attgtaaccaactgggacg -3',下游引物:5'- tctccagggaggaagagg -3'(扩增产物490bp)。PCR扩增反应条件为:变性940C 30s,退火640C 30S,延伸720C 30S,反应循环数为30。反应完毕扩增产物用2.0%琼脂糖凝胶电泳,应用凝胶成像分析系统半定量分析电泳条带的吸光度,结果以目的基因与β-actin吸光度的比值表示。
    1.5数据统计学分析 所有数据经过方差齐性检验和正态性检验,用均数±标准差( )表示,采用SPSS 13.0统计软件进行单因素方差分析,p<0.05表示差异具有统计学意义。
    2 结果
    2.1 免疫组织化学法测定TNF-α蛋白的表达
    TNF-α阳性反应物质主要分布在细胞浆,显色为红褐色。假手术组见少量TNF-α阳性细胞。模型组TNF-α阳性细胞表达较假手术组显著增多(P < 0.05)。治疗组TNF-α阳性细胞较模型组显著减少(P < 0.05)。(表1,图1)
    2.2 RT-PCR测定TNF-α mRNA 的表达
    假手术组TNF-α mRNA有微弱的表达。模型组TNF-α mRNA表达较假手术组显著上调(P < 0.05)。治疗组TNF-α mRNA表达较模型组显著下调(P < 0.05)。(表1,图2)
    表1  各组大鼠TNF-α蛋白和TNF-α mRNA表达(n=12  ±s)

    组别             TNF-α阳性细胞数       TNF-α mRNA
    假手术组         36.82±4.32             0.128±0.027         
    模型组           125.52±13.37*          0.385±0.051*        
    治疗组           85.26±7.56#            0.315±0.042#         

    与假手术组比较*P <0.05;与模型组比较#P <0.05
    图1 免疫组化法检测大鼠TNF-α表达(×400)
    TNF-α表达:A、假手术组;B、模型组;C、治疗组
    图2 RT-PCR法测定大鼠TNF-α mRNA的表达
    TNF-α mRNA表达:M、Marker;1、假手术组;2、模型组;3、治疗组
    3 讨论
    缺血性脑血管病的发病率、致残率、致死率都很高,给社会和家庭带来严重负担,及时地恢复血流有利于减轻神经功能缺损,然而血液再灌注也能导致脑组织的损伤和功能障碍[4]。再灌注本质上是组织循环功能的恢复,如果能消除再灌注损伤,则可进一步减少组织损伤,保护细胞功能和避免缺血梗死区扩大,以及促进半暗带神经元结构和功能恢复。
    脑梗死过程中炎症反应促进了脑缺血损伤的发展,是加重缺血性脑损伤和神经损伤的重要病理机制之一[5-6]。脑梗死的炎症反应是由细胞因子介导的,其中TNF-α是一种具有广泛生物学功能的多肽类细胞因子。TNF-α主要是由激活的单核细胞、巨嗜细胞分泌产生的细胞因子,T细胞、B细胞、血管内皮细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞及神经元等也是其分泌细胞[7]。在脑缺血再灌注后,TNF-α是最早产生并发挥作用的促炎细胞因子,是炎症反应的始动因素,在脑缺血早期TNF-α分泌或合成的增加是脑梗死形成的主要原因[8],它具有增加血管内皮细胞的通透性,诱导细胞黏附因子表达等作用。研究发现,缺血后1~2h内血清和脑脊液TNF-α即可激活血管内皮细胞表达细胞间黏附分子,使内皮细胞与白细胞相互作用,白细胞黏附并浸润缺血组织[9]。大脑中动脉闭塞后1h,缺血皮质TNF-αmRNA开始表达,3h后上升,12h达高峰,闭塞5d后其表达仍显著增高。侧脑室注射TNF-α可使局灶性缺血后梗死体积增大,应用单克隆抗体阻止外源性与内源性TNF-α,能显著缩小梗死体积[10]
    参考文献:
    [1]马昱,陈婕. 细胞因子在脑缺血损伤中的作用[J]. 中国临床医学,2002,9 (1):95-97.
    [2]Sairanen T,Carpen O,Karjalainen-Lindsberg ML,et al. Evolution of cerebral tumor necrosis factor-production during human ischemic stroke[J]. Stroke,2001,32:1750-1758.
    [3] Longa EZ, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats [J]. Stroke 1989, 20(1): 84-91.
    [4]Xu Z,Xu RX,Liu BS,et al. Time window characteristics of cultured
    rat hippocampal rat hippocampal neurons subjected to ischemia and
    reperfusion[J]. Chin J Traumatol,2005,8 (3):179-182.
    [5]Wang Q,Tang X N,Yenari M A. The inflammatory response in stroke [J]. J Neuroimmuno, 2007, 184(1-2): 53-68.
    [6]Pan W,Kastin A J. Tumor necrosis factor and stroke: role of the blood-brain barrier[J]. Prog Neurobiol, 2007,83(6): 363-374.
    [7]Mao M,Hua Y,Jiang X,et al.Expression of tumor necrosis
    factorαand neuronal apoptosis in the developing rat brain after neonatal stroke[J]. Neurosci Lett,2006,403 (3):227-232.
    [8]Sairanen T,Carpen O,Karjalainen-Lindsberg ML,et al.Evolution of cerebral tumor necrosis factor production during human ischemic stroke [J]. Stroke,2001,32:1750-1758.
    [9]Frijns CJ,Kappelle LJ. Inflammatory cell adhesion molecules in ischemic cerebrovascular disease [J]. Stroke,2002,33(8):2115-2122.
    [10]车玉琴,任玉峰,高杰. IGF-Ⅱ对大鼠脑缺血/再灌注损伤后海马TNF-α含量的影响[J]. 中国应用生理学杂志,2009,25(2):249-250.
    [11]侯电波,于华明,薛彦君. 天欣泰血栓心脉宁胶囊治疗急性脑梗死的疗效观察[J].辽宁中医杂志,1998(5):15.
     
     
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